Western Blot 操作步驟多，每一步的失誤都會造成全盤失敗，從試劑與設備的選擇到實驗條件的摸索，都很關鍵。如果初學者想要做好 Western Blot，記住以下的操作技巧，或許能夠事半功倍。

   一、蛋白質的樣品制備:

    蛋白質在樣品處理過程應在低溫下進行，以避免細胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（加入合適的蛋白酶抑制劑）。

    樣品建議分裝成合適的量（比如分裝出 20μL 檢測蛋白質定量用），然后 -20°或 -80℃中長期保存，注意不要反復凍融，因為會使蛋白的抗原特性發生改變。

    切莫使用不新鮮的上樣緩沖液，同時在處理時應注意將樣品與 loading buffer 混合均勻。

   二、蛋白質定量：

    如果要定量的話，一般選擇 BCA 或者 Bradford 方法，BCA 要求檢測波長為 562nm，Bradford 為 595nm。具體方法見各試劑盒說明書。為避免假陽性結果，建議先把 lysis buffer 加入 BCA 工作液或考馬 G250 混合看是否產生顏色。

    按分子克隆的說法，還是使用等體積上樣比較好。上樣總體積一般不超過 15μL，加樣孔的大限度可加 20μL 樣品。

    上樣前要將樣品置于燒杯內，在沸水中煮 3~5min 使蛋白充分變性。也可以使用 PCR 儀 95℃ 加熱 5min，效果佳，操作方便。之后樣品可以在 4℃ 冰箱短時間保存，也可在 -20℃ 冰箱保存數月，切勿反復凍融。

   三、SDS－PAGE電泳：

    未聚合的丙烯酰胺具有神經毒性，操作時應該戴手套防護。

    灌膠時掌握好速度，避免氣泡產生（注意濃度越小的膠含水越多，凝固后膠體積縮小越多）。加水液封時速度要很慢，否則膠會被沖變形。

    聚合時間由 AP 以及 TEMED 決定，通常在 30min 左右，AP 不新鮮會導致聚合變慢，氣溫較低時膠是會凝得慢一些，必要時可適當增加 AP 以及 TEMED 的量，但通常不會超過 1h，若超過 1h 甚至更長仍未聚合，應檢查配制的操作有無錯誤。推薦 APS 每周新鮮配置。

    取適當體積樣本混合 1X SDS loading buffer（事前分裝好，每次從冰箱里取一管即可），95~100℃ 加熱 5min，若有沉淀可用稍低溫度，比如 45~55℃ 加熱  1h 達到變性的目的。

    加樣前可用 5mL 注射器或加樣器先沖洗一下加樣孔。加入下一個樣品前，進樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌 3 次，以免交叉污染。上樣時，小心不要使樣品溢出而污染相臨加樣孔。

    電泳時間和電壓說法各異。一般電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉膜。為減少蛋白質條帶的擴散，上樣后應盡快進行電泳，電泳結束后也應直接或者轉印。

   四、轉膜：

    我們實驗室使用的是半干轉膜電泳槽。對于轉印 90kd 以下的蛋白，轉膜液都不用加 SDS，如果是蛋白分子量大的話可以加入 0.037% 的 SDS 。

    切濾紙和膜時一定要戴干凈手套，因為手上的蛋白會污染膜。PVDF 膜使用前用無水甲醇中浸泡 1min~2min。

    在加有轉移液的培養皿里放入裁好的膠、浸過甲醇的 PVDF 膜和濾紙，平衡 10min左右，也是為了除去濾紙和轉移膜中的氣泡以及膠上多余的 SDS。

    用槍頭或移液管在疊層的濾紙上滾動，除去氣泡。注意每疊一層就要用玻璃棒或圓筒試管趕去氣泡，因為一個氣泡的厚度對于蛋白來說都是十萬八千里的。

    用干凈紗布將疊層上面和周圍的多余緩沖液吸干。這一步很重要，寧可太干也不能太濕，太干容易燒胡，太濕的話多余的緩沖液會導致電流短路，大大降低轉移效率，如果同時轉好幾條膠的時候更要小心，有一個膠短路就會影響整體的轉移效率。

   五、免疫雜交反應：

    如果是自己配置的封閉液，應過濾一下以消除固體雜質。實際經驗表明與其封閉過夜，不如一抗孵育過夜。

    一抗一般用封閉液稀釋即可，如果背景不高用 TBST 稀釋也可以，熟練后還可以配制一些自己的復方稀釋液，用后可回收重復用 2~3 次，但回收重復利用的效果如何就要看抗體的質量，分裝的抗體不推薦回收。

    二抗作用的時間應嚴格控制，實踐證明一抗時間長點可能沒什么關系，而二抗時間若過長過短都將會直接影響結果。二抗孵育之后還要注意好好洗滌，否則顯影是背景可能臟。

    后是化學發光（ECL），顯影，定影以及凝膠圖象分析的步驟，一般來說按照說明書來操作，在此不多贅述。